雙分子熒光互補技術

細胞內蛋白質之間的相互作用或形成蛋白復合物在細胞的生命活動過程中起著重要的作用,目前有多種手段能夠實現蛋白質相互作用的研究,如免疫共沉淀、GST pull down、表面等離子共振、酵母雙雜交等。本文主要對一種近年來發展起來的蛋白質相互作用研究方法—雙分子熒光互補(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)技術做一介紹。

雙分子熒光互補技術是一種基于蛋白質互補技術發展起來的,能夠用于體內或體外檢測蛋白質相互作用的技術。其實驗原理是將熒光蛋白在合適的位點切開,形成不發熒光的兩個多肽(VN及VC),這2個片段在細胞內共表達或體外混合時,不能自發地組裝成完整的熒光蛋白且在該熒光蛋白的激發光激發時不能產生熒光。隨后分別將兩段多肽與誘餌蛋白和捕獲蛋白融合,如果誘餌蛋白和捕獲蛋白能發生相互作用,那么兩段不完整的熒光報告蛋白片段就會彼此靠近,重新形成具有活性的熒光蛋白,在該熒光蛋白的激發光激發時能產生熒光。最后通過熒光顯微鏡觀察是否存在熒光,即可判斷誘餌蛋白與捕獲蛋白是否存在相互作用。

BiTC技術原理

BiFC優缺點

優點:

  • 靈活:既能夠用于體內相互作用的研究,也能夠用于體外相互作用的研究;
  • 快速直觀:能夠在顯微鏡下直接觀察到相互作用結果;
  • 適用性廣:BiFC系統已經被成功應用于動物,植物,真菌和細菌等不同的宿主細胞中;
  • 背景干凈,靈敏度高:驗證結果只需檢測熒光的有無,背景干凈,靈敏度高;
  • 能夠檢測弱相互作用及瞬時相互作用;
  • 對儀器要求低,成本可控,數據處理相對簡單;

缺點

  • 對溫度敏感:溫度高時片段間不易互補形成完整的熒光蛋白,這會對研究細胞在生理條件下的相互作用帶來負面影響(目前,只有基于venus、citrine和cerulean的BiFC系統可以在生理溫度條件下實現片段互補);
  • 信息滯后,無法隨時觀察:BiFC系統想要檢測到熒光,需要經過兩個熒光蛋白片段互補重新形成完整的活性蛋白,以及熒光蛋白自體催化兩個過程,該過程往往需要幾分鐘到幾小時,因此觀察熒光信號滯后于蛋白質的相互作用過程,不能實時地觀察相互作用過程;

技術背景

蛋白質互補技術

BiFC是基于蛋白質互補技術發展起來的。所謂蛋白質片段互補技術(protein fragment complementation)是將某個功能蛋白切成2段,分別與另外2種目標蛋白相連形成2個融合蛋白。在一個反應體系中,如果2種目標蛋白存在相互作用,則使得2個功能蛋白質片段靠近、互補并重建功能蛋白質的活性,通過檢測功能蛋白的活性即能夠判斷兩種目標蛋白是否存在相互作用。

BiFC在沿襲蛋白質片段互補技術的基礎上進行了優化,蛋白質互補技術中功能蛋白的活性由底物反應所體現,通過檢測底物變化,來判斷蛋白質的相互作用;而BiFC技術則是利用熒光蛋白本身能夠自我催化形成熒光活性中心并產生熒光蛋白的特征光譜的特點,直接反映蛋白質之間的相互作用,技術過程更加簡單,結果更加直觀。

用于BiFC系統的熒光蛋白

目前常用于BiFC系統的熒光蛋白有GFP(greenfluorescentprotein,綠色熒光蛋白)、YFP(yellowfluorescentprotein,黃色熒光蛋白)、CFP(cyanfluorescentprotein,青色熒光蛋白)、BFP(bluefluorescentprotein,藍色熒光蛋白)、RFP(redfluorescentprotein,紅色熒光蛋白)、Venus、citrine、cerulean、mCherry等。

Venus是目前最常用于BiFC分析的熒光蛋白,因為其熒光強且背景敏感度低,是BiFC系統理想的熒光蛋白。

BiFC系統的擴展

多色熒光互補技術

2003年,Heinemann U等人在BiFC的基礎上建立起了多色熒光蛋白互補技術(multicolor fluorescent complementation analysis)。利用多色熒光蛋白互補技術能同時檢測一個細胞中多組蛋白的相互作用,其實驗原理是將多個熒光蛋白(GFP、CFP、BFP等)分別在特定位置切開后與目標蛋白連在一起形成融合蛋白,然后將這些融合蛋白混合。不同的目標蛋白間會發生相互作用,同時使不同的互補熒光蛋白片段結合,形成多個蛋白復合體,通過熒光顯微鏡可觀察到不同顏色的熒光,從而判斷多組蛋白間的相互作用。同時,多色熒光互補技術還能夠通過熒光的強度對不同組蛋白之間的相互作用強弱進行比較。

BiFC-FRET

2008 年,Shyu YJ等人將BiFC技術和 FRET 技術結合,建立了基于雙分子熒光互補的熒光共振能量轉移技術(BiFC-FRET),利用該系統能夠檢測3個蛋白之間的相互作用。BiFC-FRET系統由基于venus的BiFC系統和青色的熒光蛋白cerulean。其實驗原理為:將兩個目標蛋白分別和venus熒光蛋白的N,C端片段相連,兩目標蛋白的相互作用使得venus蛋白重建(BiFC系統)。將第三個目標蛋白與cerulean構建融合蛋白,如果該融合蛋白能夠與兩個目標蛋白的異源二聚體發生相互作用,則cerulean可以作為供體將能量共轉移至重建后的venus熒光蛋白,實現3個蛋白質相互作用的共檢測(FRET技術)。

BiFC-FRET系統

BiFC-YTH

2011年,Zheng HY等人將基于GFP和YFP的BiFC系統和酵母雙雜交(YTH)技術聯用來研究蘿卜花葉病毒在釀酒酵母、植物和昆蟲細胞中的自我相互作用。BiFC可以彌補YTH技術不足的方面,例如有些外源蛋白在酵母體內處于不同的位置,幾乎沒有可能發生相互作用,而BiFC技術可直接觀測到細胞中蛋白質問相互作用的位置。

BiFC系統應用

研究蛋白質相互作用

研究蛋白質相互作用是BiFC系統最主要應用,迄今各種BiFC系統已經被成功用于多種蛋白質的相互作用,例如體外、病毒、大腸桿菌、酵母細胞、絲狀真菌、哺乳動物細胞、植物細胞、甚至個體水平的蛋白質之間相互作用研究。除了能夠驗證蛋白質之間是否存在相互作用,BiFC系統還能夠對細胞內蛋白相互作用位置進行研究。

藥物開發

BiFC也可用于藥物開發,首先選取疾病相關的重要蛋白,基于BiFC技術開發BiFC穩轉細胞株,不同的藥物處理后檢測熒光信號就可篩選潛在的治療藥物,具有良好的應用前景。

相關閱讀

僅供科研

聯系我們

電話:(025)5889-4959

咨詢:[email protected]

地址:南京市高新開發區星火路10號

蘇ICP備14041760號

11选五开奖结果走势图 精准一头一尾中特 网站是靠什么赚钱的 加拿大快乐8开奖查询 分分彩预测app 股票新手入门k线图 pk10牛牛开奖记录 广西快3人工计划网页 四肖八码期期选一肖 白城52麻将免费开挂下载 大满贯ⅲ李逵劈鱼